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      RNA 操作注意事項與實驗技巧

      發布時間:2021-10-17      點擊次數:667

      一、操作注意事項:


      由于RNA酶的廣泛存在與難以滅活的頑固特性。使得RNA的提取純化和后續工作變得非常困難。為了保證RNA的研究工作成功,請仔細閱讀下列注意事項,相信它能幫助您解決常見的問題。


      歸根究底,RNA工作的主要問題是防止RNA酶的污染。RNA酶無處不在,在實驗操作的任何一步,任何偶然的疏忽或不當操作都有可能造成RNA酶污染,從而導致整個實驗失敗。因此,嚴格控制實驗條件,避免任何可能的污染是保證實驗成功的關鍵,必須做到以下幾點:


      1. 如果可能,實驗室應辟出專門RNA操作區,離心機、移液槍、試劑等均應專用。RNA操作區應保持清潔,并定期進行消毒。


      2. 操作過程中應自始至終佩戴拋棄式橡膠或乳膠手套,并經常更換,以避免將手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具。盡量避免使用拋棄式塑料手套。塑料手套不貼身,常常造成操作不便,而且多出部分還容易在器具上遭RNA酶污染并向未污染處傳遞,擴大污染。


      3. 盡量使用一次性槍頭、離心管等塑料制品,盡量避免與其它實驗共享器具,以防止交叉污染。推薦使用出廠前已經滅菌的槍頭和離心管,大多國外廠商供應的無菌塑料制品很少有RNA酶污染,買來后可直接用于RNA操作。許多研究者用DEPC等處理的塑料制品,往往由于二次污染而帶有RNA酶,從而導致實驗失敗。


      4. 配制溶液用的酒精,異丙醇、Tris等應采用未開封的新品。溶液需用DEPC水配制(加0.01%(體積比)DEPC至重蒸水或Mili Q級水中,處理過夜,滅菌即成DEPC水)。


      5. 所有玻璃制品都必須在240℃烘烤4小時。所有舊塑料制品都必須用0.5M的NaOH處理10分鐘,并用DEPC-H2O徹底沖洗后滅菌,也可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過夜,然后滅菌,烘干。無法用DEPC處理的用具可以用氯仿擦拭若干次,這樣通??梢韵齊NA酶的活性。


      二、樣本保存的注意事項:


      樣本一旦從生物體中分離后,細胞內的RNA就變得非常不穩定,容易降解。因此取樣后,如何保證取樣前后基因的表達模式不變,就變得非常重要。傳統方法是用液氮速凍,再放到超低溫冰箱中保存。


      目前有些廠家開發出專門的RNA保護劑,如Qiagen公司的RNAlater是具有抑制RNase和穩定RNA作用的試劑,將采集的組織樣本等直接放入到RNAlater中,即可起到穩定樣本中RNA的作用。無需液氮或干冰,方便安全地在室溫下保存一段時間,低溫可長期保存。還有對細菌樣本專用的RNAprotect Bacteria Reagent及對血液樣本專用的PAXgene™ Blood RNA System。


      三、RNA的定量與純度:


      RNA通常用分光光度計定量,測量在260 nm處的吸收值(A260)。通常分光光度計A260的讀數要介于0.15-1.0之間才是可靠的,因此RNA提取結束后,要根據大概產量稀釋(推薦用10 mM Tris-HCl, pH 7.0稀釋)到適當濃度范圍,再用分光光度計測量。A260為1相當于RNA的濃度為40ug/ml。


      為了檢測RNA的純度,可以測量A260與A280的比值,通常純RNA的A260/A280為1.9-2.1。

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